Магнитный силикагель

Способность многих силикатов (стекла, кварца, диатомовой земли, силикагеля и т.п.) обратимо сорбировать ДНК и РНК, обнаруженная ещё в 70-х годах прошлого века, широко используется для выделения и очистки нуклеиновых кислот. Оптимальные условия сорбции/десорбции подбираются эмпирически, поскольку теоретическое обоснование высокой специфичности таких сорбентов до сих пор отсутствует. В результате десятки компаний производят сотни различных наборов, "оптимизированных" для выделения ДНК и/или РНК из различных источников. Такие специализированные наборы обычно рассчитаны на выделение микрограммовых или даже нанограммовых количеств ДНК/РНК, предназначенных для проведения ПЦР или NGS. Увеличение масштабов выделения является непозволительной роскошью из-за неоправданно высокой стоимости китов, включающих сорбенты и различные растворы. И это при том, что все подобные растворы стоят копейки и их не сложно приготовить из доступных реактивов. Сложнее с магносорбентами. Их проще купить, причём не где-нибудь, а здесь. На то есть две причины - низкая цена (20 мл - 6000 руб., 100 мл - 25000 руб.) и высокое качество.

Цена определена для суспензии, содержащей 5% сухого сорбента  (~50% сырого). Это примерно в 5 раз меньше цены наиболее известных российских конкурентов, предлагающих 1 мл силикатного магносорбента за 1600 руб.. Качество же определяется нескольким параметрами. Разбираться со всеми ключевыми параметрами должны разработчики, но знание некоторых основ может пригодиться и пользователям.

1. Размеры частиц. Субмикронные частицы слишком медленно отделяются магнитным полем и плохо ресуспендируются. Микронные частицы хорошо ресуспендируются, но при диаметре больше трёх микрон быстро оседают и без магнитного поля. Поэтому оптимальный диаметр составляет 1...3 мкм. Магнитный силикагель состоит из частиц диаметром 1,2...2,5 мкм.

2. Фракционный состав. Желателен минимальный разброс размеров частиц и отсутствие примесей медленно оседающих наночастич. Отклонение размеров у частиц магнитного силикагеля не превышает 20%. Мелкие примеси в нём отсутствуют.

3. Форма частиц. Особого значения не имеет, поэтому корейцы, запатентовавшие эмульсионный способ получения силикатных магносорбентов, гордятся их идеальной сферической формой. При неровной поверхности частиц производители упирают на их повышенную сорбционную ёмкость. Частицы магнитного силикагеля состоят из мезопористых сферических конгломератов субмикронных частиц, что обеспечивает их высокую сорбционную ёмкость

4. Окисление магнетита. Парамагнитные свойства сорбентов обычно определяются содержанием в них магнетита (Fe3O4) - окиси двухвалентного и трёхвалентного железа в соотношении 1:2 (FeO/Fe2O3). Окисление содержащегося в чёрном магнетите двухвалентного железа кислородом воздуха приводит к образованию коричневого маггемита (гамма-Fe2O3). При этом парамагнитные свойства сохраняются, но окисление сорбентов сопровождается выделением свободных кислородных радикалов (OH*, O2*-), повреждающих ДНК/РНК. В магнитном силикагеле магнетит заранее окислен до маггемита и свободные кислородные радикалы не образуются.

5. Силикатное покрытие. Силикатные оболочки магносорбентов обычно формируют при помощи щелочного гидролиза тетраэтоксисилана (реакции Стобера) или подкисления масляной эмульсии частиц магнетита, суспендированных в растворе силиката натрия. В обоих случаях парамагнитные частицы покрываются слоем силикагеля, который может отличаться концентрацией и размерами пор. Чем выше концентрация силикагеля, тем прочнее покрытие. Чем крупнее поры, тем выше его сорбционная ёмкость. Технология получения магнитного силикагеля обеспечивает получение прочного покрытия с крупными порами.

6. Сорбционные свойства. Определяются реакцией конденсации силанольных (Si-OH) групп силикатного покрытия сорбента и фосфатных (P-OH) групп нуклеиновых кислот с образованием кремний-фосфорных эфирных связей Si-O-P при pH< 7. Для взаимодействия отрицательно заряженных нуклеиновых кислот с отрицательно заряженной поверхностью силикатных сорбентов необходима ещё высокая ионная сила, уменьшающая их отталкивание (>0,2 М NaCl). Отсюда следует, что при pH<7,0 и высокой ионной силе сорбционные свойства магнитного силикагеля не хуже (и не лучше) свойств любых других силикатных сорбентов.

7. Скорость десорбции. Определяется концентрацией гидроксилов (величиной pH) и продолжительностью реакции гидролиза эфирных связей Si-O-P. Отсюда следует, что для десорбции ДНК и РНК чем выше pH, тем лучше. Но при pH>9,2 двунитевая ДНК денатурирует, а РНК гидролизуется. Нужно учитывать и то, что низкая ионная сила способствует десорбции ДНК/РНК, но принципиального значения не имеет. Намного важнее продолжительность гидролиза эфирных связей. Поэтому для десорбции нуклеиновых кислот желательно использовать буферные растворы с pH 9,0. И не торопиться.

8. Влияние Mg2+. Двухвалентные катионы магния связываются силикатами. Взаимодействие ДНК с покрытым Mg2+ сорбентом  может определяться не реакцией конденсации силанольных и фосфатных групп, а анионообменными свойствами положительно заряженной поверхности сорбента. ДНК по-прежнему сорбируется, но уже независимо от ионной силы и pH. И для её десорбции требуется ЭДТА, а не щелочной гидролиз. Этот тип сорбции (в присутствии 5 мМ Mg2+) применяется в наборах для ускоренного ("безсолевого") выделения ДНК, но такое ускорение полезно далеко не всегда. Устранить влияние Mg2+ на сорбцию и десорбцию нуклеиновых кислот можно добавлением избытка ЭДТА.

9. Контроль pH. Основная причина потери ДНК/РНК при выделении с помощью силикатных магносорбентов - несоблюдение pH при сорбции (<7,0)  и десорбции (>8,0). Поэтому pH желательно контролировать. И очень внимательно. Лучше всего для этого подходит кислотно-основной индикатор крезоловый красный - жёлтый при pH<7, 2 и тёмно-красный при pH>8,8. Тем более, что он не влияет на ПЦР. При покупке магнитного силикагеля 1 мл 0,1% раствора крезолового красного можно заказать бесплатно.

 

10. Промывка концентрата. Частицы силикагеля обладают абразивными свойствами и при трении друг о друга образуют наноразмерные примеси. Поэтому перед использованием магнитного силикагеля его необходимо промыть сорбционным буфером для удаления мелких примесей и оптимизации pH.

Набралось 10 заповедей. Их может быть и больше, но не стоит нарушать традиции.


Заявки на тестовые образцы магнитного силикагеля принимаются по E-mail. Их основные параметры описаны в спецификации (Lot 2 -  20.05.2015.pdf).

Образцы - Лот 2

Положительные отзывы можно оставлять на форуме сайта molbiol.ru. Отрицательные принимаются по E-mail.